YAC vectors contain all the elements needed to maintain a prokaryotic chromosome in the yeast nucleus: a yeast origin of replication, two selectable markers, and specialized sequences derived from the telomeres and centromere needed for stability and proper segregation of the chromosomes at cell division.

In preparation for its use in cloning, the vector is propagated as a circular bacterial plasmid and then isolated and purified. Cleavage with a restriction endonuclease (BamHI) removes a length of DNA between two telomere sequences, leaving the telomeres at the ends of the linearized DN Cleavage at another internal site by EcoRI divides the vector into two DNA segments, referred to as vector arms, each with a different selectable marker.

The genomic DNA to be cloned is prepared by partial digestion with restriction endonucleases to obtain a suitable fragment size. DNA fragments of appropriate size (up to about 2 × 10 6 bp) are mixed with the prepared vector arms and ligated. The ligation mixture is then used to transform yeast cells (pretreated to partially degrade their cell walls) with these very large DNA molecules—which now have the structure and size to be considered yeast chromosomes. Culture on a medium that requires the presence of both selectable marker genes ensures the growth of only those yeast cells that contain an artificial chromosome with a large insert sandwiched between the two vector arms.

Those with inserts of more than 150,000 bp are nearly as stable as normal cellular chromosomes, whereas those with inserts of less than 100,000 bp are gradually lost during mitosis.